IPTG (isopropiel-β-D-tiogalaktosied) is 'n analoog van β-galaktosidasesubstraat, wat hoogs induseerbaar is. Onder die induksie van IPTG kan die induseerder 'n kompleks met die repressorproteïen vorm, sodat die konformasie van die repressorproteïen verander word, sodat dit nie met die teikengeen gekombineer kan word nie, en die teikengeen doeltreffend uitgedruk word. So hoe moet die konsentrasie van IPTG tydens die eksperiment bepaal word? Is hoe groter hoe beter?
Eerstens, laat ons die beginsel van IPTG-induksie verstaan: E. coli se laktose-operon (element) bevat drie strukturele gene, Z, Y en A, wat onderskeidelik β-galaktosidase, permease en asetieltransferase kodeer. lacZ hidroliseer laktose in glukose en galaktose, of in allolaktose; lacY laat laktose in die omgewing deur die selmembraan beweeg en die sel binnedring; lacA dra die asetielgroep oor van asetiel-CoA na β-galaktosied, wat die verwydering van die toksiese effek behels. Daarbenewens is daar 'n operasionele volgorde O, 'n beginvolgorde P en 'n regulatoriese geen I. Die I-geenkode is 'n repressorproteïen wat aan die posisie O van die operatorvolgorde kan bind, sodat die operon (meta) onderdruk en afgeskakel word. Daar is ook 'n bindingsplek vir die kataboliese geenaktivatorproteïen-CAP-bindingsplek stroomop van die inisiasievolgorde P. Die P-volgorde, O-volgorde en CAP-bindingsplek vorm saam die regulatoriese gebied van die lac-operon. Die koderende gene van die drie ensieme word deur dieselfde regulatoriese gebied gereguleer om die gekoördineerde uitdrukking van geenprodukte te verkry.
In die afwesigheid van laktose is die lac-operon (meta) in 'n toestand van repressie. Op hierdie tydstip bind die lac-repressor wat deur die I-volgorde onder beheer van die PI-promotorvolgorde uitgedruk word, aan die O-volgorde, wat verhoed dat RNA-polimerase aan die P-volgorde bind en transkripsie-inisiasie inhibeer; wanneer laktose teenwoordig is, kan die lac-operon (meta) geïnduseer word. In hierdie operon (meta)-stelsel is die eintlike induseerder nie laktose self nie. Laktose dring die sel binne en word deur β-galaktosidase gekataliseer om na allolaktose omgeskakel te word. Laasgenoemde, as 'n induseerdermolekule, bind aan die repressorproteïen en verander die proteïenkonformasie, wat lei tot die dissosiasie van die repressorproteïen van die O-volgorde en transkripsie. Isopropyltiogalaktosied (IPTG) het dieselfde effek as allolaktose. Dit is 'n baie kragtige induseerder wat nie deur bakterieë gemetaboliseer word nie en baie stabiel is, daarom word dit wyd in laboratoriums gebruik.
Hoe om die optimale konsentrasie van IPTG te bepaal? Neem E. coli as voorbeeld.
Die geneties gemanipuleerde E. coli BL21-stam wat die positiewe rekombinante pGEX (CGRP/msCT) bevat, is in LB-vloeibare medium wat 50μg·mL-1 Amp bevat, geïnokuleer en oornag by 37°C gekweek. Die bogenoemde kultuur is in 10 bottels van 50mL vars LB-vloeibare medium wat 50μg·mL-1 Amp bevat, geïnokuleer teen 'n verhouding van 1:100 vir uitbreidingskultuur, en toe die OD600-waarde 0.6~0.8 was, is IPTG by die finale konsentrasie gevoeg. Dit is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Na induksie by dieselfde temperatuur en dieselfde tyd, is 1 mL van die bakteriese oplossing daaruit geneem, en die bakteriese selle is deur sentrifugering versamel en aan SDS-PAGE onderwerp om die invloed van verskillende IPTG-konsentrasies op proteïenuitdrukking te analiseer, en dan die IPTG-konsentrasie met die grootste proteïenuitdrukking te kies.
Na eksperimente sal gevind word dat die konsentrasie IPTG nie so groot as moontlik is nie. Dit is omdat IPTG 'n sekere toksisiteit vir bakterieë het. Oorskryding van die konsentrasie sal ook die sel doodmaak; en oor die algemeen hoop ons dat hoe meer oplosbare proteïene in die sel uitgedruk word, hoe beter, maar in baie gevalle wanneer die konsentrasie IPTG te hoog is, sal 'n groot hoeveelheid insluiting gevorm word. Liggaam, maar die hoeveelheid oplosbare proteïen verminder. Daarom is die mees geskikte IPTG-konsentrasie dikwels nie hoe groter hoe beter nie, maar hoe laer die konsentrasie.
Die doel van induksie en kweek van geneties gemanipuleerde stamme is om die opbrengs van die teikenproteïen te verhoog en koste te verminder. Die uitdrukking van die teikengeen word nie net beïnvloed deur die stam se eie faktore en die uitdrukkingsplasmied nie, maar ook deur ander eksterne toestande, soos die konsentrasie van die induseerder, die induksietemperatuur en die induksietyd. Daarom is dit oor die algemeen die beste om die induksietyd, temperatuur en IPTG-konsentrasie te bestudeer voordat 'n onbekende proteïen uitgedruk en gesuiwer word om die toepaslike toestande te kies en die beste eksperimentele resultate te verkry.
Plasingstyd: 31 Desember 2021